当您刚毕业并进入工作时，与一堆名词面对的实时定量PCR实验接触，您是否对从哪里开始感到困惑？ 放大曲线，标准曲线，阈值，CT值，熔解曲线和基线的含义是什么？ 那些实验的荧光图像太亮了，但我似乎无法识别它们。 今天，我们将带您分两个部分学习这些知识和概念：专业术语和常见问题。

第一部分专业条款

1.扩增曲线

放大曲线是指曲线，其中循环数为横坐标和反应期间的实时荧光强度为PCR过程中的纵坐标。

2.基线

基线指的是，在PCR扩增反应的前几个周期中，荧光信号几乎没有变化。 信号级别显示接近直线，这种直线是基线。

3.荧光阈值设置

通常，PCR反应的前15个周期的荧光信号用作荧光背景信号，荧光阈值是PCR 3-15个周期期间荧光信号的标准偏差的10倍，并设置了荧光阈值 在PCR扩增的指数阶段。 通常，每个仪器在使用前都有其荧光阈值。

4. CT值

CT值表示当荧光信号达到设定阈值时，每个PCR反应管都会发生的循环数。 从研究中，我们知道每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数之间存在线性关系。 初始副本编号越多，CT值越小，反之亦然。 使用具有已知起始副本编号的标准，可以制作校准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，而纵坐标表示CT值。 因此，只要获得未知样品的CT值，就可以从标准曲线中计算样品的初始拷贝数。

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有几个指标可以判断放大曲线是否良好：

答：曲线的拐点很明显，尤其是低重分样品的指数相很明显，放大曲线的总体平行性很好，基线是平坦的，没有上升现象，并且低 - 级的指数相位 浓度样品放大曲线很明显。

B：曲线指数相的斜率与扩增效率成正比，斜率越大，放大效率越高。

C：标准的基线是平坦或略微降低的，没有明显的向上趋势。

D：每个管的扩增曲线的并行性很好，表明每个反应管的扩增效率相似。

5.熔化曲线
当PCR产物加热时，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解离，从而导致荧光强度降低。 当达到一定温度时，大量产品分离，导致荧光急剧降低。 使用此功能以及不同PCR产物的不同TM值使荧光信号迅速下降的温度也不同，这可能是识别PCR特异性的好方法。
6.熔化曲线（采用对数曲线）
以熔解曲线的对数形成峰值图，以更直观地显示产品片段的情况。 由于熔化温度是DNA片段的TM值，因此可以确定某些影响DNA片段TM值的参数，例如片段大小，GC含量等。通常，根据我们的底漆设计原理，通常会说 放大产物的长度在80-300bp的范围内，熔化温度应在80°C和90°C之间。
答：如果在80°C和90°C之间只有一个主峰，则意味着荧光定量PCR是完美的。
B：如果主峰出现在80°C和90°C之间，并且杂质峰出现在80°C以下，则基本上考虑了引物二聚体。 这是一个不错的选择，试图提高退火温度解决。
C：如果主峰出现在80°C和90°C之间，并且当温度升高时出现流浪峰，则基本上考虑了DNA污染。 并且需要在实验的初始阶段去除DNA。
7.标准曲线线
将标准标准稀释至不同的浓度，并用作PCR反应的模板。 标准曲线以标准拷贝数的对数为横坐标，将测量的CT值作为纵坐标绘制。 量化未知样品时，可以根据未知样品的CT值从标准曲线获得样品的拷贝数。 标准曲线对于绝对定量非常重要。

第二部分。 常见问题

Q1：RT-PCR，QPCR，实时PCR和实时RT-PCR有什么区别？

A1：RT-PCR是逆转录PCR，它是聚合酶链反应的广泛使用的变体。 在RT-PCR中，将RNA链反转录为互补DNA，然后用作PCR通过PCR扩增DNA的模板。

实时PCR和QPCR是同一件事，两者都是实时定量PCR，这意味着PCR过程中的每个周期都有数据的实时记录。 这样，可以精确分析启动模板的数量。

尽管实时PCR和逆转录PCR似乎都可以缩写为RT-PCR，但国际公约是RT-PCR专门指的是逆转录PCR，而实时PCR通常被缩写为qPCR（量化实际真实的真实真实真实的真实PCR）  - 时间PCR）。

实时RT-PCR（RT-QPCR）是一种逆转录PCR，结合了荧光定量技术：从RNA到获得cDNA（RT）的首次逆转录，然后使用实时PCR进行定量分析（QPCR）。

Q2：为什么在80-300bp的范围内控制荧光定量PCR的放大产物片段的长度？

A2：每个基因序列的长度不同，其中一些是几个Kb和几百个BP。 但是，当我们设计底漆时，我们只需要要求产品的长度为80-300bp，而太短或太长不适合定量PCR检测。

产品片段太短，无法与引物二聚体区分开。 引物二聚体的长度约为30-40bp，当它小于80bp时，很难区分它是引物二聚体还是产品。 如果产品片段太长，超过300bp，这很容易导致放大效率较低，并且无法有效检测基因的量。

例如，当您计算教室里的人数时，您只需要计算有多少个嘴巴即可。 检测基因时也是如此。 您只需要检测一个基因的某个序列即可表示整个序列。 如果您既计算嘴巴的数量，又要计算鼻子，耳朵和眼镜的数量以计算人数，那么犯错很容易。

Q3：底漆设计的最佳长度是多少？

A3：一般而言，20-24bp范围内的底漆长度很好。 当然，我们必须在设计底漆时注意底漆TM值，因为它与最佳退火温度有关。 经过大量实验，已经证明60℃是一个很好的TM值。 低退火温度很容易导致非特异性扩增，而高退火温度通常会导致放大效率低，放大曲线的晚期峰和延迟的CT值。

问题4：收集的样品量会影响实验结果吗？

A4：不。显然，收集的样品越多，提取的RNA越多，cDNA越多，目标片段就会越多。 对于绝对定量，要计算目标片段的拷贝数，收集的样品量肯定会影响实验结果。 例如，检测血液中丙型肝炎病毒HBV的是以一定量（1ml）的血液检测HBV含量。

对于科学研究中通常使用的相对定量，样品的数量与实验结果无关，因为相对定量是指靶基因与参考基因之间的比较。 只是请认为它们是同一核酸链中存在的上游和下游片段。 如果样本量很大，则参考基因和靶基因均以同等比例同时增加，这不会影响结果。

Q5：逆转录酶的效率会影响实验结果吗？

A5：与上面相同。 请注意，我们希望获得更高的逆转录效率，但是我们更渴望逆转录酶的逆转录效率相对稳定并获得均匀的结果。 这将是对主要公司逆转录套件的优化功能的测试。

问题6：TAQ酶的效率会影响实验结果吗？

A6：TAQ酶的效率相对较大。 通常，需要热启动的taq酶，并且效率相对较高。 对于商业荧光定量试剂盒，每个制造商将根据自己的产品接近100％的产品来优化最佳状态的效率，如果效率太低，则无法获得实验结果。 对于不同公司的产品，这是质量的衡量标准。

问题7：荧光染料的量会影响实验结果吗？

A7：是的，会。 如果荧光染料太饱和，则会引起某些仪器的噪声干扰。 如果荧光染料未饱和，并且荧光值太低，则它将尽早进入高原相，并且放大曲线将是平坦的。 在荧光定量实验中，主要看到CT值，因此对于晚期扩增曲线而言，进入高原阶段并不重要，但是该图不够美丽。 如果您必须做出选择，则首先选择荧光染料稍微不饱和。 但是，当使用同一公司的同一产品时，其效果基本上可以忽略不计。

问题8：PCR管的透射会影响实验结果吗？

A8：是的。 但是，对于来自同一制造商的同一批消耗品，可以忽略这种效果。 这是一个不错的选择，最好使用带有高渗透性膜的96孔板来最大程度地减少消耗品的光透射率的影响。

Q9：操作期间的误差会影响实验结果吗？

A9：操作过程的影响主要反映在均匀性中。 均匀性意味着系统中的所有组件均匀混合在一起，瞬时离心可以解决此问题。 此外，对于初学者，最好将PCR系统调整为20英寸以上，而一个太小的系统更容易出现错误。 如果正确优化退火温度，则底漆浓度对CT的影响最小化。 而且您会知道，可以通过优化退火温度来避免一些操作错误（例如底漆浓度）。

总结

以上是新手在实验期间经常遇到的一些问题和疑问，我们希望这些问题可以帮助您解决一些困惑。 实验是产生混乱和解决问题的过程，希望您能从中得到一些东西。 感谢您的阅读，我们下次会见您！