一、实验环境的准备
无菌操作是细胞培养的关键。实验室应定期进行清洁和消毒，包括工作台面、培养箱、移液器等设备。例如，在使用超净工作台前，需提前开启紫外灯照射 30 分钟进行消毒。
保持实验室内适宜的温度和湿度，一般来说，温度应控制在 18 - 26°C，湿度在 40% - 60%之间。
二、细胞培养用品的处理
培养器皿如培养瓶、培养皿等在使用前必须进行严格的灭菌处理。
可以采用高温高压灭菌或者干热灭菌的方法。
培养基和血清等试剂在使用前应检查是否有污染和变质。
如发现培养基颜色异常、浑浊或者有沉淀，应停止使用。
三、细胞的复苏和传代
细胞复苏时，应迅速将冻存管从液氮中取出，放入 37°C 水浴中快速解冻，避免长时间处于室温导致细胞受损。
以某肿瘤细胞系为例，如果解冻时间过长，可能会导致细胞存活率显著降低。
传代时要控制好细胞的密度，避免细胞过度密集或稀疏。
对于某些贴壁细胞，当细胞汇合度达到 80% - 90%时进行传代较为适宜。
四、培养基的配制和使用
照配方准确配制培养基，确保各种成分的浓度和比例正确。
例如，在配制含有血清的培养基时，血清的添加量要严格按照要求进行。
培养基在使用过程中应注意观察 pH 值的变化，如有必要，及时进行调整。
五、细胞的观察和监测
定期在显微镜下观察细胞的形态、生长状态和密度。
如发现细胞形态异常、出现空泡或者细胞碎片增多等情况，可能提示细胞受到了污染或者生长环境不佳。
注意监测培养箱内的温度、二氧化碳浓度和湿度等参数，确保其稳定在合适的范围内。
六、防止细胞污染
操作过程中要严格遵守无菌原则，佩戴口罩、帽子和手套。
避免不同细胞系之间的交叉污染，使用专用的移液器和培养器具。
七、细胞培养过程中的常见问题及解决方法
解决方法：检查培养基成分和血清质量，适当提高细胞接种密度，调整培养箱参数。
细胞污染原因：无菌操作不严格、培养用品灭菌不彻底、实验环境有污染等。
解决方法：立即丢弃污染的细胞培养物，对实验室进行彻底清洁和消毒，严格规范操作流程。
细胞形态改变原因：可能是细胞老化、支原体污染、培养基成分变化等。
解决方法：及时传代细胞，进行支原体检测和清除，检查培养基成分。
细胞聚团原因：细胞本身特性、消化过度或不足、培养基中钙离子浓度过高等。
解决方法：根据细胞特性选择合适的消化方法和时间，调整培养基成分。
总之，细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，只有严格遵守各项操作规范和注意事项，才能保证细胞培养的成功和实验结果的准确性。