贴壁细胞通常在平面表面上培养，例如由细胞培养皿或烧瓶提供的表面。通过培养基进行气体和营养交换，因此必须彻底优化条件以支持细胞生长。贴壁细胞培养固有的问题包括附着不良、产量或活力受损，以及产生不均匀的细胞单层，这些问题在细胞扩增过程中会变得更加明显。本文重点介绍了这些问题的一些常见原因，并提供了在常规细胞培养和放大过程中预防这些问题的有用建议。
贴壁细胞培养的挑战
贴壁细胞培养的一个主要挑战在于让细胞附着在培养容器上。这在低血清或无血清培养基中培养细胞时尤其成问题，因为细胞粘附和扩散通常需要血清中的附着蛋白（玻连蛋白和纤连蛋白）。另一个问题是确保为细胞提供足够的氧气和营养物质，以避免损害活力或引发可能在下游进一步造成问题的表型变化。细胞单层均匀分布也很重要。均匀分布不仅促进一致的细胞生长，而且还最大限度地增加了可以从培养容器中收获的细胞数量。
预防常见的生长问题
通过采用贴壁细胞培养的最佳实践，可以轻松克服刚刚描述的挑战。可以通过允许细胞多次传代以适应血清减少或无血清条件或使用具有特殊处理表面的培养容器来促进附着。应仔细选择有效的涂层，包括聚-L-赖氨酸、明胶、胶原蛋白和各种专有配方，以适应细胞类型。通过预热和预充气使培养基达到正确的 pH 值也有助于细胞更快地粘附，并且在使用较大的培养容器时特别有益。
由于容器大小和培养基体积会对气体交换和氧气输送到贴壁细胞产生重大影响，因此必须仔细优化培养基高度。培养基高度应足够低，以使氧气从顶部空间自由流动到细胞，但又应足够高，以提供足够的营养物质来支持健康的细胞生长。通常建议使用每 cm 2生长面积 0.2–0.4 mL 生长培养基进行贴壁细胞培养。
为避免产生不均匀的单层，细胞接种物应在添加到培养容器后与培养基进行充分而温和的混合。这可以通过小心地左右倾斜培养皿或使用大口径血清移液管执行几个缓慢的抽吸和分配步骤来实现。在生物安全柜和培养箱之间更换培养基或移动培养物时，避免产生剪切力也很重要。当培养基扫过细胞时会发生剪切，导致部分单层分离。温和的处理技术消除了这些问题，还可以帮助防止气泡的形成，这些气泡可以阻止新鲜接种的细胞粘附或导致已经附着的细胞坏死。
应用最佳实践来扩大规模
研究人员扩大贴壁细胞培养的原因有很多。这些包括产生用于免疫测定应用（如蛋白质印迹或 ELISA）的细胞裂解物，在单克隆抗体开发过程中扩增产生抗体的克隆，以及生产各种细胞疗法。无论最终目标如何，扩大规模都要求随着船舶规模的增加保持一致的增长；这是确保细胞特征不改变的关键。
典型的放大操作可能会将细胞从多孔板、细胞培养皿、烧瓶中取出，最终在多层烧瓶中生长。后者旨在在不占用 CO 2培养箱中过多空间的情况下最大限度地提高产量，并且现在可以使用允许在与传统 175 cm² 烧瓶共享相同占地面积的容器中培养多达十层贴壁细胞的模型。其中包括 Falcon ®细胞培养多功能培养瓶（提供 525 cm 2和 875 cm 2）和 Corning ® HYPERFlask ®细胞培养容器（1720 cm²）。对于更大的放大容量，其他选项包括滚瓶（最大 1,750 cm²）、Corning ®CellSTACK ®培养室（最大 25,440 平方厘米），以及可连接到生物反应器的高度复杂的封闭灌注系统（最大 85,000 平方厘米）。
重要的是要记住，较小的容器可以在放大之前彻底优化培养条件。例如，多孔板或培养皿可用于比较不同的培养基配方，或在细胞在烧瓶等较大容器中生长之前确定最佳接种浓度。培养基体积应在整个扩增过程中保持恒定（mL 培养基/cm²），以避免引入可能在更大范围内产生更显着影响的变异性。